高分辨率熔解曲線(xiàn)（HRM）分析指南

      HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲線(xiàn))同許多熒光PCR技術(shù)一樣，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA雙鏈小溝中（PCR產(chǎn)物）的特性，通過(guò)實(shí)時(shí)監測升溫過(guò)程中dsDNA解鏈，熒光染料脫落，熒光信號減弱或消失的過(guò)程，高分辨記錄熔解曲線(xiàn)，從而對樣品進(jìn)行檢測。HRM技術(shù)利用dsDNA的物理性質(zhì)，準確反映DNA序列堿基配對特異性與解鏈溫度變化的情況，無(wú)需使用特異性標記探針，不受突變種類(lèi)和突變位點(diǎn)的限制，具有高靈敏度和特異性、高通量、操作簡(jiǎn)單靈活、成本低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗室檢測證明，在PCR反應前或反應后加入飽和dsDNA染料，對HRM分析，效果相同。在PCR后加入，可閉管進(jìn)行HRM分析，無(wú)需凝膠電泳。HRM分析，不損傷PCR產(chǎn)物，用于HRM分析的PCR產(chǎn)物仍可用于電泳、膠回收、測序等一系列后續操作。HRM可應用于核酸突變掃描、基因分型、甲基化檢測、短串聯(lián)重復序列分析、序列匹配和RNA編輯等多方面研究，已越來(lái)越受到國內外核酸分子實(shí)驗室的歡迎和重視。

      對于目前絕大多數的突變分析方法來(lái)說(shuō)，都很難鑒定出純合子序列突變。在一些不同種類(lèi)的小的擴增片段中，高分辨率熔解曲線(xiàn)則顯示出了鑒定純合子序列突變的能力，這種方法能鑒定出大多數的純合突變。HRM技術(shù)在遺傳學(xué)研究方面也帶來(lái)很大便利，只需在PCR反應體系中加入雙鏈DNA飽和熒光染料，在PCR反應之后再花15 分鐘，就可以完成96或384個(gè)樣品的DNA變異掃描。采用這種方法，當片段的大小在400bp或者更小時(shí)，靈敏性zui高。

一、HRM分析條件

1. 設備

      PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)*取決于DNA堿基序列，序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生突變，都會(huì )改變dsDNA的解鏈溫度。但是這種變化差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，HRM技術(shù)需要區分Tm值差異極小的樣品，以鑒別單個(gè)堿基的差異，因此，對溫度分辨率的要求相當高，如果儀器的分辨率不高，是無(wú)法檢測的?？组g溫度差異（溫度均一性：Tm的標準偏差為0.020～0.264℃），孔間溫度均一性要達到0.264℃以?xún)炔拍鼙ＷCHRM分析結果的準確性。熔解速率，zui低要求0.1℃/秒。數據密度，zui低要求10個(gè)數據點(diǎn)/℃。目前市場(chǎng)上HRM分析儀器的供應商，有專(zhuān)門(mén)用于HRM分析的儀器，也有附帶HRM功能的Real Time PCR儀。這些廠(chǎng)家包括：Roche, QIAGEN, Idaho Technology。市場(chǎng)上認可度較高的一些設備包括: HR-1、LightScanner-32、LightScanner-96和LightScanner-384(Idaho Technology Inc)，可采集55～95℃的熒光信號，變溫速率是0.02～0.1℃／s，每秒鐘可以采集200個(gè)數據資料。LightCycler 480s(Roche Diagnostics, Germany)和Rotor-Gene6000(Corbett)等傳統實(shí)時(shí)定量PCR儀加裝高分辨率熔解模塊后，采用qPCR-HRM方法可以實(shí)現對目的核酸片段的定量和定性檢測。

2. 染料

      進(jìn)行HRM分析的另一個(gè)必要條件是飽和染料。用于HRM分析的染料必須滿(mǎn)足兩個(gè)條件。首先，必須是飽和染料。所謂飽和染料是指染料必須能飽和結合于DNA雙鏈所有小溝位置，也就是染料相對于dsDNA要相對過(guò)量，以使dsDNA沒(méi)有更多位置結合染料，在dsDNA升溫解鏈時(shí)，飽和染料從雙鏈上脫落，熒光信號同步減弱，準確反應出樣品熔解溫度（Tm）、熔解曲線(xiàn)的不同（如圖1-A）。SYBR Green I染料廣泛用于qPCR，但屬于非飽和染料，不能封閉dsDNA的所有小溝位置，遠未將DNA雙螺旋結構中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫逐步變性時(shí)，部分熒光染料分子會(huì )隨機結合到尚未解鏈的雙鏈DNA空置的小溝位置，染料分子發(fā)生重排，造成熒光信號混亂，特異性下降，不能準確反映dsDNA解鏈過(guò)程（如圖1-B）

圖1：dsDNA解鏈前后熒光染料結合情況。A(左圖):飽和染料在dsDNA解鏈時(shí)，熒光分子同步脫落，信號減弱。B(右圖):不飽和染料在dsDNA解鏈時(shí)，熒光分子重新結合于未解鏈的dsDNA部位，熒光信號沒(méi)有變化，不能反應樣品熔解溫度(Tm)。

       其次，染料不能抑制PCR反應。SYBR Green I染料不是飽和染料，加大染料濃度，不但不能飽和結合dsDNA小溝位置，還會(huì )抑制PCR反應進(jìn)行，造成擴增反應無(wú)序，混亂。

      用于HRM分析熒光染料如LC Green, Ly Green, eva Green等均為飽和染料，能飽和結合于PCR反應產(chǎn)物的雙鏈小溝內，同時(shí)這些染料不會(huì )抑制PCR反應。Ly Green為2015年推出的HRM分析染料，除具有飽和染料、不抑制PCR等特點(diǎn)外，熒光信號穩定、實(shí)驗重復性好時(shí)期突出優(yōu)點(diǎn)（如圖2）。

圖2. LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析.

HRM分析設備為L(cháng)ightCycler@480熒光定量PCR儀(德國羅氏)

二、HRM分析流程

1. 引物設計合成

       據基因序列應用Oligo軟件設計、合成正向引物，反向引物（或依據參考文獻）。將引物稀釋成10mmol/L的工作濃度,-20℃保存備用。

2. 反應體系

注：1）50µL反應，根據引物及擴增DNA長(cháng)度不同，可進(jìn)行優(yōu)化。

2）染料在反應前加入或反應后加入對反應影響不大，反應前加入，可實(shí)現閉管操作。

3. 擴增及HRM程序

三、HRM分析局限性及解決辦法

1. 熔解設備自身溫差。在所有的熔解系統中，孔與孔之間都存在微小的溫度差異，故影響檢測的靈敏性。如果孔與孔間的溫度差異為0.1℃，則zui終的樣品熔解溫差也可能是0.1℃。因此，HRM對儀器溫度的均一性要求非常高。為解決這一問(wèn)題，可以在PCR體系中加入2種溫度內標，低溫時(shí)熔解和高溫時(shí)熔解。HRM儀上的分析軟件可以根據這2種內標的熔解峰在熔解曲線(xiàn)中的位置來(lái)糾正孔與孔之間的溫度差異，可顯著(zhù)提高檢測的靈敏性。

2. PCR反應體系和反應條件。PCR反應體系中，核酸模板質(zhì)量要經(jīng)過(guò)檢測，濃度要均一。在分析多樣本時(shí)，模板外的其他共同組分要先混合均勻后，再分別加入樣品模板，以保證反應體系的均一性。若在PCR反應后加入飽和熒光染料，通常不需要對反應條件做任何改變；若在PCR反應前加入染料，可以實(shí)現真正的閉管操作，避免污染。但此時(shí)需要對原來(lái)的反應條件做一定的改變，通常需要增加Mg2+濃度2～3 mmol/L，增加退火溫度1～5℃。隨著(zhù)Mg2+濃度的增加，Tm值也會(huì )升高，當Tm值超過(guò)熔解設備所允許的zui高溫度時(shí)，還需要加入二甲基亞砜DMSO(10％)或甜菜堿(0.5 mol/L)來(lái)降低Tm值。在某些情況下，為快速找到反應體系zui適的退火溫度，需要做梯度PCR試驗。在PCR反應程序的zui后，一定要加入解鏈和退火的步驟，以增加PCR產(chǎn)物的雜合度，提高試驗的分辨率和準確度。

3. 引物的二聚體。PCR產(chǎn)物高純度的PCR特異性產(chǎn)物是獲得HRM分析結果較高特異性的前提，在PCR引物設計時(shí)，一定要避免引物的二聚體和發(fā)卡結構，盡量降低基因組其他片段的非特異性結合。根據所用擴增酶的情況，要嚴格控制PCR反應的循環(huán)數，以降低非特異性擴增增加的風(fēng)險。根據試驗目的，要嚴格控制擴增片段的長(cháng)度。試驗結果表明，隨著(zhù)擴增片段長(cháng)度的增加，HRM結果的靈敏度和特異性會(huì )降低，當擴增片段長(cháng)度為400-1000 bp時(shí)，檢測的靈敏度為96.1％，異性為99.4％。對于一些差異只有1-2 bp的基因片段進(jìn)行分型時(shí)，需要借助探針才能解決。擴增子不能太長(cháng)，當檢測大片段如整個(gè)外顯子或內含子的突變位點(diǎn)時(shí)，就要使用多對引物，將大片段分別擴增檢測。同其他任何基于PCR反應的突變檢測一樣，HRM不能檢測外顯子、內含子或整個(gè)基因等大片段的缺失突變。

4. 轉換純合突變子檢測。目的片段突變或多態(tài)位點(diǎn)的類(lèi)型在轉換、顛換、插入和缺失4大類(lèi)堿基突變類(lèi)型中，雜合突變子產(chǎn)生的Tm值差異zui大，顛換純合突變子的Tm值差異在0.8～1.4℃之間，HRM技術(shù)可以對其準確分型。但轉換純合突變子產(chǎn)生的Tm值差異通常小于0.4℃，HRM技術(shù)不能對其準確分型，此時(shí)需要采用小片段法或非標記探針?lè )?。使用小片段法時(shí)，片段長(cháng)度一般設計為40～90 bp，包含1個(gè)SNP位點(diǎn)為宜。使用探針?lè )〞r(shí)，熔解曲線(xiàn)上會(huì )出現2個(gè)峰圖，可以進(jìn)行2次SNPs分析，且探針與其互補區結合形成的雙鏈部分更短，更能增加試驗的靈敏度，從而增加對純合突變子的分型準確性。

5. 樣品的提取方法一致。樣品基因組提取方法樣品基因組不同的提取方法會(huì )對PCR后產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)的形狀和分析結果產(chǎn)生很大的影響，因此，待分析樣品的提取方法要一致。為找出較為合適的提取方法，實(shí)驗室可根據自身條件設計不同基因組提取方法對HRM結果影響的試驗，找到較為理想的提取方法或較為理想的基因組提取試劑盒。

6. 飽和熒光染料的差異LC-Green、Syt09、ResoLight Dye和Ly Green,等飽和熒光染料的性質(zhì)差異不大，可以相互替代，試驗時(shí)只需要對PCR緩沖液和反應條件做微小的調整即可。SYBR Green I染料為非飽和熒光染料，在檢測核酸微小變異時(shí)存在缺陷，因此一些研究者們不建議采用。

四、HRM技術(shù)展望

HRM技術(shù)具有高通量、高靈敏度和特異性、操作簡(jiǎn)單靈活、成本低、對DNA分子無(wú)損害、閉管操作等諸多優(yōu)點(diǎn)。在畜牧業(yè)方面，通過(guò)對畜禽基因組突變位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性分析和連鎖性分析，HRM技術(shù)可以鑒定出更多的與畜禽特定經(jīng)濟性狀相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，增加畜禽參考群育種值估計的準確性，還可以增加畜禽分子疾病的檢出率，并為其遺傳疾病和基因突變所致疾病的分子診斷提供革命性手段。在農業(yè)方面，HRM技術(shù)將增加作物遺傳標記位點(diǎn)的密度，加快作物高產(chǎn)、抗逆性等優(yōu)良性狀的改良進(jìn)度。隨著(zhù)消費者食品安全意識的增強和行業(yè)競爭的日趨激烈，對食品微量成分種類(lèi)和含量的檢測日益重要，HRM技術(shù)因其較高的靈敏度和特異性，必將發(fā)展成為一種可靠便捷的檢測手段。在人類(lèi)疾病的診斷方面，HRM技術(shù)必已經(jīng)從試驗研究走向臨床診斷，成為人類(lèi)分子疾病臨床診斷的新手段。因此，HRM技術(shù)的應用范圍將會(huì )進(jìn)一步拓寬，并越來(lái)越受到核酸研究者的重視。

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