cy染料小動(dòng)物活體成像操作流程

吲哚花菁綠(ICG，indocyanine green)是經(jīng)過(guò)FDA認證的菁染料，出于安全考慮，后期應用于活體（人、動(dòng)物、細胞）的染料在結構上都和ICG有相似或相近之處。cy系列染料是Amersham公司（目前為GE公司）zui初開(kāi)發(fā)的染料體系，它的橋環(huán)由苯并吲哚變?yōu)檫胚岘h(huán)，并在吲哚的苯環(huán)上對稱(chēng)地引入硫酸根基團，水溶性得到很大改善，分子量降低后對大分子的親和力有所增加。cy系列菁染料多帶有羥基琥珀酰亞胺活性酯(NHS ester)、異硫氰酸酯(NCS)等活性基團，可與蛋白質(zhì)、多肽、DNA或其他生物分子中的羥基、氨基或巰基以化學(xué)鍵的方式鍵合，表征生物分子的特性，形成具有生物功能的標記衍生物，廣泛被用于抗體、多肽、小分子等多種熒光探針的合成中，可以說(shuō)是目前使用的一類(lèi)近紅外染料。cy染料應選擇GE、李記生物等公司產(chǎn)品，化工企業(yè)提供的cy染料產(chǎn)品，一般不作為活體成像使用。

一、Cy染料在活體成像的應用領(lǐng)域

1. 標記特異性抗體

在CY菁染料標記蛋白的研究中，除了牛血清白蛋白以外zui先開(kāi)始涉及的功能性物質(zhì)是抗體。從起初與IgG結合，用熒光光纖免疫傳感器(FFOI，fluorescent fiber-optic immunosensor)考察抗原抗體反應，到現在連接特異性的單克隆抗體片段，對動(dòng)物全身進(jìn)行免疫熒光顯影，分析片段在體內的分布代謝情況。分析cy-抗體復合物在不同時(shí)間不同器官中的熒光強度變化，可對抗體的靶向性、清除率等有更直觀(guān)的評價(jià)。不過(guò)，染料抗體衍生物在降低背景噪音和非特異性吸附方面還有待進(jìn)一步完善。

2. 標記特異性多肽(Conjugating to peptides)

在腫瘤診斷和治療中，與菁染料衍生物結合的多肽主要有兩種：其一是針對腫瘤表面過(guò)量表達的受體；另一種則針對腫瘤相關(guān)酶類(lèi)。前者的報道很多，如生長(cháng)激素抑制素、表皮生長(cháng)因子，甚至一些特殊設計過(guò)的短肽，都可以被用來(lái)靶向結合腫瘤，現在更趨向于一些只有十幾個(gè)氨基酸的環(huán)肽，因為它分子量小易于接近腫瘤部位，且呈環(huán)狀構形不易被分解。Cy系列染料均能利用自身攜帶的活性基團直接與環(huán)肽結合，部分此類(lèi)探針檢測發(fā)現，在近紅外光學(xué)顯影和放射顯影在淺表的分辨率相似，但在深層組織中前者的信噪比更高。針對酶類(lèi)研究一般是設計酶特異性熒光探針，這種與Cy系列染料結合的檢測技術(shù)除了在體內定位時(shí)有顯著(zhù)優(yōu)勢外，亦可作為體外檢測手段與一些常用技術(shù)結合，輔助確定組織中該酶的存在。

3. 與藥物載體結合(Conjugating to drug carriers)

現在生物可降解的、靶向性高的載體是藥學(xué)制劑領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而近紅外染料為研究這些載體的體內行為提供了一種新思路。這些載體主體一般是由多聚谷氨酸、PGC等多聚物組成的骨架，骨架側鏈上有很多活性基團，可以同時(shí)連接上數個(gè)靶向功能模塊和染料分子，所以在裝載藥物之前就可以先利用熒光顯影對該載體的靶向性等作出評價(jià)。這個(gè)領(lǐng)域的報道比較少，現在多選用結構較小的單克隆抗體片段或葉酸這些小分子作為藥物載體上的靶向模塊與Cy系列染料、ICG衍生物等結合，進(jìn)一步完善對這些載體的研究可以為疾病確定和定位給藥帶來(lái)新的希望。

二、cy染料活化基團的選擇

依需要標記的抗原、抗體、酶、多肽等分子所帶的可標記基團的種類(lèi)（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性，選擇相應的活化染料和反應條件。為減少空間位阻影響，可在cy染料與被標記物之間加入交聯(lián)臂結構。常見(jiàn)抗體、抗原、酶、多肽對應的染料活化基團如下：

1.標記氨基的活化基團：NHS ester (N-羥基丁二酰亞胺酯)。

2.標記醛基的活化基團：Hydrazide酰肼。多的用于神經(jīng)元細胞的電極失蹤和神經(jīng)縫隙連接研究

3.標記巰基的活化基團：Maleimide，馬來(lái)酰亞胺 

三、小動(dòng)物活體成像操作流程

以研究腫瘤靶向信號肽為例，介紹小動(dòng)物活體成像實(shí)驗流程。本實(shí)驗人工給小鼠接種皮下腫瘤，然后制備cy7-信號肽復合體（探針），通過(guò)尾靜脈注射小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)做活體成像分析，觀(guān)察cy7-信號肽復合體（探針）在體內的特異性分布。

1.實(shí)驗動(dòng)物準備（動(dòng)物模型建立）

1) SPF級 BALB/C裸鼠，5～8 周齡，18～20克，自由進(jìn)食、水。飼養1周后接種細胞，分組或混編分籠飼養。12小時(shí)光照/日,明暗交替。相對濕度50%±10%、溫度23±2℃。

2) 細胞培養瓶中培養CNE-1細胞（實(shí)驗室根據具體情況），取對數生長(cháng)期，胰酶常規消化,離心，富集，利用無(wú)菌PBS清洗細胞，離心，富集，重復上述過(guò)程3次，zui后用無(wú)菌PBS液調整細胞濃度為l×10⁷個(gè)/ml，收集細胞于離心管內。

3) 細胞接種取0.1ml CNE-1細胞懸浮液接種于每只小鼠的雙后肢大腿。根部皮下，雙后肢皮下注射相同腫瘤細胞數，每處1×10⁶個(gè)細胞。

4) 成瘤觀(guān)察繼續飼養，觀(guān)察細胞接種后的生長(cháng)狀況，大約5-6天后可見(jiàn)瘤塊，待約1-2 周后，腫瘤長(cháng)至約0.5-0.8cm直徑，開(kāi)始做體內多肽靶向實(shí)驗。

注意：1)動(dòng)物分組、陰性對照、陽(yáng)性對照根據具體實(shí)驗設置；

2)實(shí)驗動(dòng)物接種腫瘤后，注射熒光探針前，可根據實(shí)驗目的給藥或做其他處理。

2.標記復合物制備

利用Cy7 NHS ester上琥珀酰亞胺基與信號肽末端以及側鏈氨基的反應，將熒光分子Cy7 NHS ester連接到多肽上，形成Cy7-信號肽的熒光多肽復合物（探針）。

1) Cy7反應液準備。避光條件下,將1mg Cy7 NHS ester溶于200μL二甲基亞砜，終濃度5 mg/ml，20μl/管分裝，每離心管含Cy7 NHS ester 100 μg，用鋁箔紙包好，置于-80 ℃冰箱避光冷凍備用。

2) 帶標記信號肽準備。取2mg多肽，溶解于0.1 M NaHCO₃ 溶液，終濃度為1 mg/ml。

3) Cy-信號標記復合物生產(chǎn)。按照信號肽:Cy7-NHS=7:1(molar ratio)的比例，混合信號肽溶液與Cy7-NHS 溶液，放置于恒溫震蕩反應器中，室溫25℃避光震蕩反應4小時(shí)（如圖1.）

4) 標記復合物純化。用SephadexG-15凝膠柱純化、收集標記復合物，低溫干燥濃縮。

注意：1）染料標記復合物生成的反應條件需根據待標記大分子與熒光染料活性基團具體進(jìn)行調整。

2）NHS用于標記氨基，因此標記復合物生成反應溶液中需要除去帶氨基的成分，一般通過(guò)多次半滲透后濃縮的辦法把待標記大分子溶液中的其他帶氨基成分去除。

3）標記復合物的純化，需根據復合物的分子大小，理化及生物學(xué)性質(zhì)選擇合適方法。

圖1：cy NHS ester與氨基反應形成標記復合物

3. 活體內靶向分布實(shí)驗

1) 小鼠于成像前6小時(shí)開(kāi)始禁食，以降低因胃腸道食物引起的背景干擾。

2) 通過(guò)小鼠尾靜脈注射0.1ml Cy7-信號肽溶液（濃度1mg/mL），或Cy7標記復合物稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射200μL(濃度0.5 mg/mL)[*用量和時(shí)間需要客戶(hù)根據自己的儀器和藥物試劑等條件優(yōu)化]。對照組實(shí)驗小鼠注射從尾靜脈注射游離cy7染料溶液（1mg/mL）0.1ml

3) 注射后，分別于1h、2h、15h、24h、48h后，用10%水合氯醛溶液按0.35ml/100mg體重腹腔注射麻醉小鼠（*次麻醉后應給小鼠脫毛，減少毛發(fā)產(chǎn)生的背景熒光干擾），用膠帶固定在治療床上，根據腫瘤部位，采取合適體位(如圖2.)

4) 小動(dòng)物活體成像系統分別對小鼠全身及腫瘤部位熒光掃描成像, Ex/Em(nm): 749/776。

5) 記錄動(dòng)物在體內發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光復合物（探針、藥物）的分布情況。比較不同分組小鼠（陰性陽(yáng)性對照組）的熒光分布情況。

6) 成像結束后，根據實(shí)驗需要，選擇是否要解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進(jìn)行成像分析。

注意：

1) 根據實(shí)驗需要通過(guò)尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種細胞、組織或已標記的探針。在建模時(shí)應認真考慮實(shí)驗目的和cy染料（cy5, cy5.5, cy7）熒光波長(cháng)，建模時(shí)不宜接種深部臟器和觀(guān)察熒光，但可以觀(guān)察皮下瘤和解剖后臟器直接成像。深部臟器和體內轉移的觀(guān)察大多選用熒光素酶標記。

2) 不同cy染料活性部位可標記不同基團，確保反應體系內去除與待標記基團競爭性結合cy染料的試劑，本例中，用cy7 NHS ester標記多肽氨基，應通過(guò)半滲透等方法盡量去除反應體系內其他攜帶氨基的分子，避免攜帶cy7染料的物質(zhì)被注射進(jìn)小鼠體內影響實(shí)驗結果。

3) 本例中通過(guò)標記探針與特異性靶點(diǎn)的結合改變熒光信號的體內分布，在一些設計中，也可通過(guò)探針與靶點(diǎn)結合導致的空間位置改變，淬滅熒光信號。

圖2：注射標記探針、麻醉、脫毛后的實(shí)驗小鼠

圖3：注射cy-多肽標記復合物的小鼠與對照組分別成像

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