蛋白酶K具有廣泛的底物特異性
更新時(shí)間:2019-12-27 點(diǎn)擊次數:1419
蛋白酶K具有廣泛的底物特異性。即便存在洗滌劑的情況下,其仍可降解許多非變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)。蛋白酶K分離自一種可在角質(zhì)上生長(cháng)的真菌白色側齒霉菌(Engyodontiumalbum)(前稱(chēng)腐生真菌(Tritirachiumalbum)。因此,蛋白酶K能夠降解非變性狀態(tài)的角質(zhì)(頭發(fā)),因而稱(chēng)為“蛋白酶K”。1其切割的主要位點(diǎn)為帶有封閉氨基基團、鄰近脂族或芳香族氨基酸羧基端的肽鍵。因其廣泛的特異性,其較為常用。
蛋白酶K(ProteinaseK),相對分子量約為29.3kDa,是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶??汕懈钪灏被岷头枷阕灏被岬聂然穗逆I,應用廣泛,可用于制備脈沖電泳的染色體DNA,蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實(shí)驗,蛋白酶K的一般工作濃度是50—100µg/ml。因蛋白酶K在變性劑如SDS(1%)中可提高其活性,所以在使用中,常根據所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。蛋白酶K在較廣的pH范圍內(pH4-12.5)均有活性。
蛋白酶K有兩個(gè)Ca2+結合位點(diǎn),它們離酶的活性中心有一定距離,與催化機理并無(wú)直接關(guān)系。然而,如果從該酶中除去Ca2+,由于出現遠程的結構變化,催化活性將喪失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染核酸制品的蛋白質(zhì)。所以,蛋白酶k消化過(guò)程中通常也加入EDTA(以抑制依賴(lài)于mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白,如角蛋白一類(lèi),則可能需要使用含有1mmol/lCa2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA(ph8.0)至終濃度為2mmol/l,以鰲合Ca2+。