細胞凍存原理與方法（細胞凍存液選擇）

近年來(lái)，通過(guò)輸注免疫細胞或干細胞進(jìn)行相關(guān)疾病的治療取得良好療效，細胞治療技術(shù)展示出越來(lái)越廣闊的臨床應用前景。通常細胞從采集到臨床應用會(huì )間隔很長(cháng)時(shí)間，而新鮮細胞產(chǎn)品保存時(shí)限較短，為了延長(cháng)細胞保存時(shí)限或長(cháng)期保存細胞產(chǎn)品，需要對細胞進(jìn)行冷凍后儲存。

細胞冷凍保存的原理

細胞凍存是通過(guò)冷凍保護機制將細胞放在低溫環(huán)境，減少細胞代謝，保持細胞活性，以便長(cháng)期儲存的一種技術(shù)。細胞復蘇后，蛋白質(zhì)仍有活性，細胞的結構和功能仍完好。

隨著(zhù)溫度降低，細胞內外的水分都會(huì )結晶，所形成的冰晶會(huì )造成細胞膜和細胞器的破壞，特別是0~-20℃的階段，冰晶呈針狀，極易引發(fā)細胞損傷。在不加任何保護劑條件下直接凍存細胞時(shí)，細胞內外環(huán)境中形成的冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，引起細胞死亡。

如果在細胞溶液中加入冷凍保護劑，可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑容易同水分子結合，降低冰點(diǎn)，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結形成冰晶前透出細胞，并且通過(guò)降低未結冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫（液氮）條件下保存。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關(guān)，且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。

細胞冷凍保護劑

細胞冷凍保護劑可以根據否穿透細胞膜分為滲透性和非滲透性?xún)煞N。滲透性冷凍保護劑可以透過(guò)細胞膜滲透到細胞內，多為小分子，包括二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇等，這類(lèi)保護劑能夠在細胞冷凍懸液凝固之前，穿過(guò)細胞膜滲透到細胞內，減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。DMSO是臨床級凍存保護劑中重要的成分，目前經(jīng)典的凍存保護劑中通常含有10%左右的DMSO。DMSO是常用的凍存保護劑和常用藥用輔料，在國家藥品監督管理局藥品審評中心藥用輔料數據庫可以查詢(xún)到其詳細信息。非滲透性冷凍保護劑一般是一些大分子物質(zhì)，不能滲透到細胞內，主要包括右旋糖苷、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等，其可以?xún)?yōu)先同溶液中的水分子相結合，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成。由于其分子量大，可以使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷，同時(shí)能降低溶液中低分子溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，減輕鹽損傷。

細胞冷凍保存的一般流程

細胞凍存過(guò)程要緩慢，復蘇則相反，應快速升溫。慢凍的原因如上所述，為了避免降溫時(shí)，細胞內的水分還未來(lái)得及脫離細胞，但卻形成冰晶，對細胞造成損傷。（1）凍存前觀(guān)察細胞狀態(tài)，測定細胞活率和計數。（2）將要凍存的細胞收集于離心管中，1200~1800rpm，離心5min，棄上清。（3）根據需要調整細胞凍存密度，緩慢加入適當體積配制好預冷的凍存液或市售的無(wú)血清細胞凍存液，重懸細胞。（4）將細胞懸液分裝至凍存管中，旋緊管蓋，做好標記。（5）將凍存管放入程序降溫盒（預冷）內，然后放至-80℃冰箱過(guò)夜，次日轉移至液氮罐中長(cháng)期保存。

如何選擇細胞凍存液

細胞凍存液的質(zhì)量和成分對細胞的凍存效果有很大的影響。如果細胞凍存液的成分不合適或質(zhì)量不達標，可能會(huì )導致細胞凍存失敗或細胞復蘇后存活率低。

選擇細胞凍存液時(shí)，應考慮以下3個(gè)重要因素：

（1）細胞類(lèi)型，不同的細胞類(lèi)型對細胞凍存液的成分和濃度有不同的要求。

（2）凍存時(shí)間，細胞凍存的時(shí)間越長(cháng)，對細胞凍存液的要求越高。

（3）復蘇率，細胞凍存液的質(zhì)量和成分對細胞的復蘇率有很大的影響。

下面給你介紹下李記生物~李記生物細胞凍存液的主要產(chǎn)品：

• 藥輔級細胞凍存液（非程序降溫）

• 快速細胞凍存液（GMP級）

• 無(wú)血清細胞凍存液（無(wú)DMSO）

• 無(wú)血清細胞凍存液（增強型）

• 快速細胞凍存液（無(wú)血清、無(wú)蛋白）

一、快速細胞凍存液（無(wú)血清、無(wú)蛋白）

和元李記快速細胞凍存液（無(wú)血清、無(wú)蛋白）可適應于絕大部分腫瘤細胞和常規細胞，大部分干細胞（和元李記已測試細胞種類(lèi)請關(guān)注），凍存細胞可在 -80℃ 長(cháng)期保存（＞6年）。不含動(dòng)物源性蛋白，不含血清成分，可有效減少各類(lèi)細菌、病毒和支原體等污染，保證凍存細胞的安全。該凍存液含DMSO、葡萄糖等各種細胞營(yíng)養成分，提高細胞存活率和活力，亦適合于無(wú)血清培養細胞和蛋白表達細胞。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1. 無(wú)需程序性降溫，可直接將細胞放入凍存液置于-80℃冰箱（-80℃可保存＞6年），凍存液無(wú)需稀釋。

2. 凍存液不含血清，大大降低細胞污染可能性。

3. 不要加血清，不要反復逐級降溫，不要液氮，綜合下來(lái)省時(shí)更省錢(qián)。

4. 案列可于-資源支持查詢(xún)！

5. 各細胞凍存數據，可參考下方李記凍存液數據庫（數據由使用客戶(hù)反饋）

產(chǎn)品組分

運輸與保存

常溫運輸。4℃保存，有效期24個(gè)月。

二、無(wú)血清細胞凍存液（無(wú)DMSO）

產(chǎn)品描述

李記生物無(wú)血清細胞凍存液（無(wú)DMSO）適用于多種細胞的冷凍保存，尤其適用于原代肝細胞、神經(jīng)細胞等的凍存。

訂購信息

產(chǎn)品參數

運輸與保存

藍冰運輸。4℃密封保存，有效期12個(gè)月。

三、無(wú)血清細胞凍存液（增強型）

產(chǎn)品描述

李記生物無(wú)血清細胞凍存液（增強型）適用于常用動(dòng)物細胞系的冷凍保存，尤其適用于原代細胞、干細胞等的冷凍保存。

訂購信息

產(chǎn)品參數

運輸與保存

藍冰運輸。4℃密封保存，有效期24個(gè)月。

四、快速細胞凍存液（GMP級）

產(chǎn)品描述

和元李記快速細胞凍存液（GMP級）不含動(dòng)物源性蛋白，不含血清成分，可有效減少各類(lèi)細菌、病毒和支原體等污染，保證凍存細胞的安全。通用于各種動(dòng)物細胞株，尤其適用于各類(lèi)原代細胞、干細胞及雜交瘤等蛋白表達細胞的凍存。

本產(chǎn)品含多種保護劑、穩定劑組合，可顯著(zhù)降低凍存過(guò)程中溶液冰點(diǎn)，提高細胞膜對水的通透性，有效防止冰晶對細胞的損傷；同時(shí)降低冰凍時(shí)細胞周?chē)娊赓|(zhì)濃度，避免電解質(zhì)損傷；還可延緩凍存過(guò)程中細胞的互相擠壓，保護細胞膜。從而極大提高細胞復蘇率和活力。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1. 便捷：即用型，無(wú)需程序性降溫，可直接將細胞放入凍存液置于-80℃冰箱，也可在后續轉移至液氮中進(jìn)行長(cháng)期保存。

2. 高效：細胞存活率和復蘇活力高，普遍高于90% 。

3. 安全：無(wú)血清，無(wú)動(dòng)物源成分，化學(xué)成分明確，大大降低細胞污染可能性。

4. 質(zhì)優(yōu)：嚴格的質(zhì)量控制，產(chǎn)品性能媲美進(jìn)口；所有原料均選自經(jīng)嚴格檢測的低內毒素、高純藥用級別原料，采用低DMSO配方，注射用水配置符合GMP生產(chǎn)。

5. 批間差異?。?/span>全程于GMP潔凈車(chē)間生產(chǎn)與包裝，并經(jīng)過(guò)嚴格的內毒素、滲透壓、 PH、細菌病原體等質(zhì)量檢測，確保產(chǎn)品質(zhì)量及批次間的一致性。

6. 適用范圍廣：通用于各種動(dòng)物細胞株，尤其適用于各類(lèi)原代細胞、干細胞及雜交瘤等蛋白表達細胞的凍存；已通過(guò)實(shí)驗證明不不會(huì )影響干細胞表型和生長(cháng)狀態(tài)，且可維持干細胞的多分化性。

7. 案列可于-資源支持查詢(xún)！

產(chǎn)品組分

運輸與保存

藍冰運輸。4℃保存，有效期12個(gè)月。

五、藥輔級細胞凍存液（非程序降溫）

產(chǎn)品描述

藥輔級細胞凍存液（非程序降溫）是由李記生物自主研發(fā)的含有7.5% DMSO，無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物成分的即用型細胞凍存液，在超低溫（-80℃～-196℃）環(huán)境下為細胞提供一個(gè)安全、有效的保護環(huán)境，凍存復蘇后細胞活率可達90%以上。

本產(chǎn)品含有甘氨酸，DMSO以及磷酸鹽緩沖液的水溶液，適用于間充質(zhì)干細胞的冷凍保存。

訂購信息

產(chǎn)品參數

運輸與保存

藍冰運輸。4℃密封保存，有效期24個(gè)月。

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。