活性氧ROS檢測原理及檢測步驟

ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是細胞內產(chǎn)生的一種具有氧化活性的化學(xué)物質(zhì)，包括過(guò)氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理條件下也會(huì )產(chǎn)生，但當其產(chǎn)生過(guò)多或清除不足時(shí)，會(huì )對細胞造成氧化應激，導致細胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測原理

用于檢測細胞內ROS廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針?lè )?。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過(guò)細胞膜。一旦進(jìn)入細胞，它會(huì )被細胞內的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無(wú)法穿過(guò)細胞膜，因此熒光探針會(huì )在細胞內積聚。細胞內的ROS能夠氧化無(wú)熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強度與ROS水平成正比。通過(guò)熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設備，在最大激發(fā)波長(cháng)480nm和最大發(fā)射波長(cháng)525nm下檢測熒光

檢測步驟

一、裝載探針

刺激時(shí)間較短（通常為2 h以?xún)龋┑募毎合妊b載探針，后用活性氧陽(yáng)性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。

刺激時(shí)間較長(cháng)（通常為6 h以上）的細胞：先用活性氧陽(yáng)性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

1、原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

2、收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）

二、檢測

原位裝載探針?lè )ǎ杭す夤簿劢癸@微鏡直接觀(guān)察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察。

注意事項

① 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細胞內的探針，否則會(huì )導致背景較高。

② 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(cháng)的掃描和發(fā)射波長(cháng)的掃描，以確認探針的裝載情況是否

良好。

③ 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

④ 根據結果顯示的整體熒光強度的高低，可以適當調整DCFH-DA探針的稀釋倍數以及孵育時(shí)間。