bca法測蛋白濃度原理、實(shí)驗步驟及注意事項

蛋白質(zhì)濃度測定是用于計算純化方法的回收率的重要方法。常用的測定方法包括雙縮脲法、Lowry法、紫外吸收法、BCA蛋白濃度檢測法等。其中常用的方法就是BCA法。BCA 全稱(chēng)是Bicinchoninic Acid Assay， 也叫Smith Assay，這個(gè)方法是由Paul K. Smith 發(fā)明的。這個(gè)方法通過(guò)展示不同濃度樣品的顏色變化來(lái)判斷蛋白的濃度。

檢測原理

BCA是一種堿性的水溶性復合物，性質(zhì)穩定。在其提供的堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)可以將BCA試劑中的Cu2+還原為Cu+，Cu+繼而與BCA試劑螯合，從而產(chǎn)生藍紫色的絡(luò )合物，在562nm波長(cháng)處具有強吸收峰，通過(guò)測定吸光度，結合標準曲線(xiàn)即可得知蛋白濃度。BCA法因抗干擾性強、簡(jiǎn)便準確，靈敏度高而得到廣泛應用，但其也易受溫度、孵育時(shí)間的影響。

實(shí)驗步驟

一、配制標準品和工作液

1. 配制 BSA 標準品體系（線(xiàn)性范圍 20-2000 μg/mL 或者 5-250μg /mL 標準品制備各 2 種配置方法，請根據習慣選用恰當方式）?！咀ⅰ浚築SA 標準品濃度為 2 mg/mL，稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋

白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但也可用水或 1 X PBS 進(jìn)行稀釋。BSA 標準品體系配制表（配制后可放置于 4℃ 冰箱多次使用）

2. 配制 BCA 工作液

① 計算所需要的總 BCA 工作液體積?？?BCA 工作液體積=（標準品數量+待測樣品數量）x 重復數 x 每個(gè)

樣品所需要的 BCA 工作液?！咀ⅰ浚涸嚬芊z測時(shí)每個(gè)樣品加 2.0 mL BCA 工作液，微孔板檢測每個(gè)

樣品加 200 μL BCA 工作液。

② 配制 BCA 工作液：50 體積的 BCA 試劑 A 中加入 1 體積的 BCA 試劑 B（A:B=50:1），充分混勻?！咀ⅰ浚築CA 工作液裝入密封容器內，室溫條件 24h 穩定。

二、檢測方法

1. 試管檢測方法（樣品:BCA工作液=1:20）

2.微孔板檢測方法（樣品: BCA 工作液=1:20）

① 各取 10 μL 標準品和待測樣品加入到微孔板中?！咀ⅰ浚簶悠放c工作液比例為 1:20，檢測范圍為 125-2000μg/mL。若樣品濃度非常低，可使用 25μL 標準品和待檢測樣品進(jìn)行檢測（即 1:8），這時(shí)試劑盒的檢

測范圍為 20-2000 μg/mL。

② 每孔加入 200 μL BCA 工作液，槍頭吹打充分混勻。蓋上微孔板，37℃ 孵育 30 min。

③ 冷卻到室溫，在酶標儀上的 562 nm 波長(cháng)范圍處檢測吸光度。

④ 根據 BSA 標準品的吸光度（減去標準品中空白孔的 OD 值即最終的讀數），繪制標準曲線(xiàn)（ X-蛋白濃

度μg/mL；Y-最終的 OD 562nm）。依據標準曲線(xiàn)和樣品的稀釋倍數計算樣品蛋白濃度。

注意事項

在進(jìn)行BCA法檢測蛋白濃度的實(shí)驗過(guò)程中，精確性和可靠性是至關(guān)重要的。以下是一些關(guān)鍵的操作要點(diǎn)和在實(shí)驗過(guò)程中可能遇到的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決策略：

? 試劑的準備和存儲：確保所有試劑在使用前充分混合且在推薦的溫度下存儲。試劑的新鮮度對實(shí)驗結果有顯著(zhù)影響，過(guò)期或不當存儲的試劑可能導致不準確的結果。

? 操作順序的嚴格遵守：在進(jìn)行BCA實(shí)驗時(shí)，嚴格按照試劑添加順序和操作步驟進(jìn)行，避免任何步驟的顛倒或省略。這些步驟設計的順序是為了提高反應效率和結果的一致性。