sirna轉染實(shí)驗步驟(以 24 孔板為例)
1. 接種細胞
對于貼壁細胞:轉染前一天,將細胞按照每孔1-2x10^5個(gè)細胞的量進(jìn)行鋪板,使其在轉染時(shí)密度為60%-80% 為佳。
對于懸浮細胞:轉染當天,配制轉染試劑-核酸復合物之前,用PBS清洗細胞1-2次,用250 μL Opti-MEM I 減血清培養基 (無(wú)血清) 重懸細胞,在24孔板中進(jìn)行細胞鋪板,細胞密度為60-80%。
2. 準備轉染試劑-siRNA復合物(或轉染試劑-miRNA復合物)
(1) 對于每孔細胞,取2 μLsiRNA (20 μM,DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中,加入2 μL轉染試劑與siRNA 混合,室溫孵育3 min。
(2) 往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養基(無(wú)血清),輕輕混勻,在室溫下靜置30 min,形成轉染試劑-核酸復合物。
(3) 30 min后,往上述復合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養基(無(wú)血清),輕輕混勻。
3. 轉染細胞
(1) 細胞用PBS清洗1-2次,將上述350µL轉染試劑-siRNA復合物加入每孔細胞。
(2) 在 37℃,5% CO2 培養箱培養 24-48 h,無(wú)需更換新的培養液,之后即可檢測基因干擾效果或者后續功能實(shí)驗。注:可在轉染12h后補充500 μL完培養基 (含血清)。
siRNA轉染試劑推薦
EZ Trans siRNA轉染試劑,是一種基于陽(yáng)離子高分子聚合物開(kāi)發(fā)的新型轉染試劑,適用于siRNA 及microRNA (miRNA) 的轉染。本產(chǎn)品能在多種常見(jiàn)細胞中實(shí)現高效率、低毒性的轉染效果,且具有操作簡(jiǎn)便,重復性佳等優(yōu)點(diǎn),適用于 siRNA或miRNA 介導的基因抑制實(shí)驗。
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