siRNA轉染實(shí)驗步驟及實(shí)驗原理

siRNA是目前基礎研究中常用的基因沉默（基因干擾）形式之一，方便快捷，在各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現及藥物篩選中廣泛應用。常規siRNA產(chǎn)品為凍干粉形式的即用型試劑，-20°保存。進(jìn)行特異性靶點(diǎn)設計，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因，借助化學(xué)轉染技術(shù)適合進(jìn)行各種細胞RNAi實(shí)驗。此外，通過(guò)對siRNA進(jìn)行特殊化學(xué)修飾，可以實(shí)現在體內實(shí)驗更加高效、特異、穩定。

siRNA轉染原理

siRNA在細胞中降解mRNA的機制與miRNA類(lèi)似（如上圖），合成的siRNA通過(guò)胞吞進(jìn)入細胞中，隨后少量的 siRNA 能夠發(fā)生溶酶體逃逸進(jìn)入細胞質(zhì)，進(jìn)入細胞質(zhì)后siRNA與 Dicer 及 TRBP 形成 RISC復合物，RISC復合物招募 AGO2，隨后正義鏈被降解，siRNA 反義鏈與互補配對的 mRNA 序列結合，接著(zhù) AGO2 對mRNA 進(jìn)行切割，最終引起 mRNA 的降解。

siRNA轉染實(shí)驗步驟（下面以 24 孔板為例，其他培養皿中轉染可以咨詢(xún)李記生物）

1、接種細胞

   對于貼壁細胞：轉染前一天，將細胞按照每孔1-2x10^5個(gè)細胞的量進(jìn)行鋪板，使其在轉染時(shí)密度為60%-80% 為佳。

   對于懸浮細胞：轉染當天，配制轉染試劑-核酸復合物之前，用PBS清洗細胞1-2次，用250 μL Opti-MEM I 減血清培養基 (無(wú)血清) 重懸細胞，在24孔板中進(jìn)行細胞鋪板，細胞密度為60-80%。

2、準備轉染試劑-siRNA復合物（或轉染試劑-miRNA復合物）

   (1)對于每孔細胞，取2 μLsiRNA (20 μM，DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中，加入2 μL轉染試劑與siRNA 混合，室溫孵育3 min。

   (2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養基(無(wú)血清)，輕輕混勻，在室溫下靜置30 min，形成轉染試劑-核酸復合物。

   (3)30 min后，往上述復合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養基(無(wú)血清)，輕輕混勻。

3、轉染細胞

   (1)細胞用PBS清洗1-2次，將上述350µL轉染試劑-siRNA復合物加入每孔細胞。

   (2)在 37℃，5% CO2 培養箱培養 24-48 h，無(wú)需更換新的培養液，之后即可檢測基因干擾效果或者后續功能實(shí)驗。注：可在轉染12h后補充500 μL培養基。

siRNA轉染效率驗證

siRNA沉默效果分析siRNA 轉染細胞后，siRNA 在  細胞內一系列酶的作用下形成RNA誘導的沉默復合物，識別并切割靶基因mRNA，誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應， 從而抑制了細胞內目的基因蛋白的表達，一般可從兩個(gè)方面進(jìn)行檢測。

 • mRNA 水平 - QPCR檢測

  siRNA的作用機理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明。一般在siRNA轉染后24小時(shí)后即可檢測到靶mRNA水平的降低，可采用細胞總RNA提取，全長(cháng)cDNA合成，熒光定量實(shí)驗即可檢測到mRNA 的敲除效率。

 • 蛋白水平 - WB檢測

  siRNA引起靶基因mRNA的降解，從而影響了靶蛋白的表達。但蛋白水平檢測時(shí)間受細胞內目的蛋白表達量、穩定性、半衰期、甚至其他調控等因素的影響，蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線(xiàn)性正比關(guān)系。一般在轉染后48后開(kāi)始WB檢測，72，96 小時(shí)，甚至更長(cháng)時(shí)間之后多點(diǎn)采樣。