關(guān)于高保真DNA聚合酶的應用領(lǐng)域
更新時(shí)間:2018-05-09 點(diǎn)擊次數:1141
高保真DNA聚合酶具有廣泛的模板適應性,優(yōu)化的緩沖體系廣泛適用于各種類(lèi)型模板,便于快速得到理想的擴增結果,提供PCR Enhancer以幫助擴增高GC含量的模板,提供即用型的預混液,zui大程度地減少實(shí)驗步驟。
高保真DNA聚合酶真性的一個(gè)通用標準是錯配率,錯配率越低保真性越好,普通Taq酶的錯配率在10-5堿基/循環(huán)數,而高保真Taq酶錯配率可降到10-6數量級,大大降低了出錯的可能性;它適合對PCR保真性要求較高的實(shí)驗,如基因篩選、測序、突變檢測等。
高保真DNA聚合酶理化性質(zhì),純化的DNApolⅠ由一條多肽鏈組成,約含1000個(gè)氨基酸殘基,MW為109KD。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)-SH基。通過(guò)二個(gè)酶分子上的-SH基與Hg2+結合產(chǎn)生二聚體,仍有活性。每個(gè)酶分子中含有一個(gè)Zn2+,在DNA聚合反應起著(zhù)很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細胞中含有約400個(gè)分子,每個(gè)分子每分鐘在37℃下能催化667個(gè)核苷酸摻入正在生長(cháng)的DNA鏈。經(jīng)過(guò)枯草桿菌蛋白酶處理后,酶分子分裂成兩個(gè)片段,大片段分子量為76KD,通常稱(chēng)為Klenow片段,小片段的分子量為34KD。此酶的模板專(zhuān)一性和底物專(zhuān)一性均較差,它可以用人工合成的RNA作為模板,也可以用核苷酸為底物。在無(wú)模板和引物時(shí)還可以從頭合成同聚物或異聚物。
高保真DNA聚合酶保真原理是,高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶的活性,PCR擴增途中如果產(chǎn)生了錯配的堿基,它可以將其切掉,從而保證了擴增的準確性;需要提醒的是由于此酶具有核酸外切酶功能,往往擴增效率低一些,有的還會(huì )降解引物,而且產(chǎn)物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。高保真DNA聚合酶的外切活性會(huì )導致PCR反應之后不會(huì )加尾,所以如果要進(jìn)行TA克隆,要先進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收(否則影響加尾),然后回收產(chǎn)物用普通Taq酶72度保溫一段時(shí)間,從而利用普通Taq酶加尾的活性。具有zui高的保真度和zui強的擴增能力,高保真DNA Polymerase,其保真度是Taq DNA Polymerase的52倍,是Pfu DNA Polymerase的6倍,擴增速度是常規聚合酶的4-150倍。