間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基

產(chǎn)品描述

間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基是一款無(wú)外源動(dòng)物成分的人間充質(zhì)gan細胞培養基?？蓱糜谌四殠ЫM織來(lái)源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內毒素水平遠低于中國藥典標準，生產(chǎn)過(guò)程遵循ISO9001 體系,并符合GMP 指導原則。

間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基主要成分：氨基酸，維生素、無(wú)機鹽、白蛋白，轉鐵蛋白、胰島素、微量元素，細胞因子等。主要用于人臍帶來(lái)源的干細胞原代分離、擴增與傳代培養。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存

干冰運輸。組分A在4℃保存，組分B在-20℃保存，混合后4℃保存，有效期12個(gè)月。

使用方法

間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基配制

1. 37℃快速解凍組分B，快速溶解時(shí)不易破壞添加劑中營(yíng)養物質(zhì)，時(shí)間大致為10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎培養基中，分裝后添加劑立即儲存于-20℃至-80℃，避免反復凍融。

2. 將組分B以10%比例加入到組分A中，混勻，即為間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基?；旌虾笈囵B基可在4℃ 穩定儲存2-3 周，不建議使用已配制超過(guò)3 周的培養基。

3. 間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基可直接應用于人類(lèi)臍帶組織來(lái)源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養。

4. 預先高溫高壓滅菌處理剪刀，鑷子等實(shí)驗器械。

5. 預先紫外滅菌超凈臺/安全柜等實(shí)驗環(huán)境。

【注】以下步驟皆應在無(wú)菌條件下操作：

1. 間充質(zhì)干細胞原代分離（貼壁法）

臍帶簡(jiǎn)介：臍帶包括臍帶血、華通氏膠、兩根動(dòng)脈、一根靜脈，所有這些結構被臍帶上皮（內襯膜）包裹。臍帶是間充質(zhì)干細胞的主要來(lái)源，其中華通氏膠只含有間充質(zhì)干細胞一種干細胞，是常用來(lái)分離培養間充質(zhì)干細胞的結構。而內襯膜則含有至少兩種干細胞：間充質(zhì)干細胞和上皮干細胞，這兩種干細胞也是細胞治療的主要來(lái)源。以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質(zhì)干細胞詳細步驟：

1.1. 無(wú)菌收集長(cháng)度約10cm 的臍帶，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液的50mL離心管中。在4℃條件下快速運到實(shí)驗室，在4h 內處理完成全部過(guò)程。

1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑10cm 培養皿中。用預冷的PBS 多次清洗臍帶，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過(guò)程確保全程臍帶浸泡在預冷PBS 中保持濕潤。

1.3. 使用剪刀徑向剖開(kāi)臍帶，將血管以及周?chē)娜A通氏膠暴露出來(lái)。

1.4. 用解*刀將華通氏膠與血管分離，用鑷子夾住血管，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人類(lèi)臍帶結構參見(jiàn)圖1）。

1.5. 用剪刀將華通氏膠剪成0.5-1cm 見(jiàn)方的薄片組織塊，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內襯膜）組織棄除。

注意：組織塊盡量接近片狀，增大與培養皿接觸面積，提高細胞爬出率

1.6. 每個(gè)直徑10cm 的培養皿中放置10-15 個(gè)組織塊，加入6mL 完培養基。置于37℃，5%CO2培養箱中培養不同原代分離體系初始組織塊數量以及細胞爬出率見(jiàn)表1。

注意：①為促進(jìn)組織塊貼壁，培養基不能加太多，否則組織塊容易漂起 ②為促進(jìn)組織塊貼壁，72 小時(shí)內不能搖晃培養皿，72 小時(shí)第一次換液也是同理。

表1.臍帶組織塊粘壁數據（平均數據）

1.7. 每72 小時(shí)換液。一般5-7 d可以看見(jiàn)貼壁組織塊附近有細胞爬出，12-15 d細胞匯合度達到70%以上，即可準備傳代。

1.8. 細胞傳代時(shí)，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養基，加入5mL PBS 清洗一次。每個(gè)直徑10mL，的培養皿中加入5mL 的細胞消化液，搖勻覆蓋皿底，37℃恒溫箱2-3min 或室溫3-5min 孵育。

1.9. 顯微鏡下觀(guān)察到大部分克隆邊緣開(kāi)始脫離皿底，輕輕敲打皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入同體積完培養基，用移液槍扇形吹打使細胞完脫落下來(lái)，將細胞懸液收集到15mL 離心管中，300×g離心5min。

1.10. 用完培養基重懸、計數，此時(shí)的細胞稱(chēng)為P0 代。相關(guān)代次預期收獲細胞量請參考表2。

1.11. 根據本公司統計數據，10cm 長(cháng)的臍帶，約可以收獲1.24×107 個(gè)P0 代細胞，一根臍帶長(cháng)度大約20cm，約可以收獲2.5×107 個(gè)P0 代細胞。

1.12. 根據本公司檢測，按1:8 傳代，細胞形態(tài)在P10 代內不發(fā)生變化。P10 代以上細胞沒(méi)有實(shí)際應用意義，暫不檢測。

1.13. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異，近胎盤(pán)端分離效率要高于近胎兒端10-30%。

表2.10cm 長(cháng)的臍帶P0-P5 代預計收獲細胞數量（1:8 傳代）

2. 間充質(zhì)干細胞傳代培養

2.1. 在顯微鏡下觀(guān)察細胞，細胞匯合度達到90%，即可準備傳代;

2.2. 吸掉培養瓶/皿中的培養基，用PBS 清洗一次，加入適量的細胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/皿底，37℃恒溫箱2-3min 或室溫3-5min 孵育。

2.3. 顯微鏡下觀(guān)察到大部分克隆邊緣開(kāi)始脫離瓶/皿底，輕輕敲打瓶/皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入等倍體積的完培養基，用移液槍扇形吹打使細胞脫落下來(lái)，并輕輕吹打成單細胞，將細胞懸液收集到適當的離心管中，室溫300×g 離心5min。

2.4. 棄上清，加入適量完培養基，重懸細胞，按照比例進(jìn)行傳代或計數后按照1.1-1.45×104 個(gè)/cm2密度進(jìn)行接種。均勻鋪在培養皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 條件下培養。相關(guān)數據請見(jiàn)表3。

注意：細胞規模生產(chǎn)建議1:5-1:8 傳代，一般72 小時(shí)可以達到90%以上匯合度。

表3.不同體系建議細胞接種數量及加液量

3. 人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存

3.1. 同步驟2.1；

3.2. 同步驟2.2；

3.3. 同步驟2.3；

3.4. 棄上清，用4℃保存的無(wú)血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）重懸細胞，取部分細胞計數。

注意：無(wú)血清細胞凍存液即拿即用，用完之后盡快放回4℃冰箱，以防室溫放置太久，影響質(zhì)量。

3.5. 計數后用無(wú)血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）調節細胞密度至建議凍存密度1-5×106個(gè)/mL，每支凍存管（需提前做好標記）分裝1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存。

3.6. -80℃放置過(guò)夜后轉移至液氮長(cháng)期保存。

4. 間充質(zhì)干細胞復蘇

4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解。

4.2. 在生物安全柜或超凈臺中，先在15mL 離心管中加入5 mL 37℃預熱的完培養基，將解凍后的細

胞懸液緩慢滴加到離心管中。

4.3. 300×g 離心3min，吸掉上清，加入適量完培養基重懸細胞至建議接種濃度（參考表3）。

4.4. 將細胞懸液均勻滴加到培養瓶/皿中，水平十字振動(dòng)培養瓶/皿使細胞均勻。置于37℃，5% CO2 條

件下培養24 小時(shí)后觀(guān)察細胞復蘇狀態(tài)。

4.5. 細胞無(wú)異常即可同時(shí)更換新鮮的完培養基繼續培養。

4.6. 初次換液后每48-72 h更換培養液直至傳代。

注意事項

1.     本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。