PEI轉(zhuǎn)染是目前工業(yè)化、大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)重組蛋白或病毒載體領(lǐng)域使用廣泛的基因載體和轉(zhuǎn)染試劑。PEI是一種帶有高電荷陽離子的多聚物,極易與帶負(fù)電荷的DNA分子結(jié)合,形成復(fù)合物。在HEK293和CHO等細(xì)胞中,采用PEI轉(zhuǎn)染法能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,尤其適用于大規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)實(shí)驗(yàn)。相較于磷酸鈣法,PEI轉(zhuǎn)染試劑制備更加簡(jiǎn)便,適用于更多種類的細(xì)胞,并且具有更高的性價(jià)比。與脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑相比,PEI轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的毒性較小。對(duì)于難以進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言,利用PEI進(jìn)行慢病毒包裝也非常方便,滿足了大多數(shù)細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的需求。
PEI轉(zhuǎn)染原理
PEI 能將 DNA 包裹成帶正電荷的微粒,這些微??梢责ず系綆в胸?fù)電荷的細(xì)胞表面殘基,并通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞,胺的質(zhì)子化導(dǎo)致反離子大量涌入以及滲透勢(shì)降低,在低pH環(huán)境中實(shí)現(xiàn)DNA胞內(nèi)釋放。最被接受的觀點(diǎn)是PEI上未質(zhì)子化的胺可以在與膜結(jié)合的細(xì)胞器(如溶酶體)中吸收氫離子,這將導(dǎo)致更多氫離子的流入,誘發(fā)滲透溶脹。而質(zhì)子化胺之間的排斥引起PEI構(gòu)象的改變,上述變化導(dǎo)致的滲透膨脹使囊泡釋放聚合物與 DNA 形成的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。復(fù)合物拆解后,DNA 能自由的融合到細(xì)胞核中。
PEI轉(zhuǎn)染操作方法
PEI轉(zhuǎn)染試劑使用比較方便,對(duì)血清與抗生素兼容性強(qiáng)。具體操作步驟范例如下(以HEK293細(xì)胞為例)
① 轉(zhuǎn)染前,確保細(xì)胞存活率大于95%,活細(xì)胞密度在(1.5~2.0)×10^6 cells/mL之間;
② 將活細(xì)胞密度稀釋至1.05×106 cells/mL;
③ 將pDNA和1 mg/mL Bestop™PEI線性轉(zhuǎn)染試劑顛倒數(shù)次,混勻;
④ 每毫升待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物轉(zhuǎn)1μg pDNA到一個(gè)干凈的小瓶中。用新鮮培養(yǎng)基稀釋至20μg/mL(5%最終培養(yǎng)體積)。
⑤ 每毫升待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物轉(zhuǎn)3μL 1 mg/mL Bestop™PEI線性轉(zhuǎn)染試劑至干凈的小瓶中。用培養(yǎng)基稀釋至60 μg/mL(5%最終培養(yǎng)體積)。
⑥ 將稀釋的pDNA和Bestop™PEI線性轉(zhuǎn)染試劑混合。顛倒幾次,在室溫下靜置10分鐘。使用前將密封的容器輕輕顛倒一次。
⑦ 每90 mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染10 mL pDNA/PEI混合物。在混合的同時(shí)逐漸將混合物加入到培養(yǎng)基中,孵育細(xì)胞。
⑧ 轉(zhuǎn)染后:如果使用增強(qiáng)劑或補(bǔ)充劑,可以在轉(zhuǎn)染后6小時(shí)的任何時(shí)間添加。傳代培養(yǎng)也可以在6小時(shí)后進(jìn)行。
如果使用GFP對(duì)照,48小時(shí)后應(yīng)觀察到轉(zhuǎn)染率超過70%。對(duì)于優(yōu)化過的方法,80%以上的轉(zhuǎn)染率是合理的。
PEI使用常見問題
Q1:多配置一點(diǎn)母液凍存起來是否會(huì)延長(zhǎng)效期?
A:不建議凍存,儲(chǔ)存液2-8℃保存3個(gè)月使用是沒問題的。
Q2:轉(zhuǎn)染后是否需要換液?
A:不需要換液,也可在轉(zhuǎn)染后6-8h觀察細(xì)胞狀態(tài)后,決定是否有必要進(jìn)行換液。
Q3:轉(zhuǎn)染的時(shí)候是否需要無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)?
A:制備復(fù)合物的時(shí)候需要使用無血清培養(yǎng)基,而加入細(xì)胞中的時(shí)候不要求無血清培養(yǎng)。
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