脂質(zhì)過氧化傳感器檢測原理、使用方法與注意事項

脂質(zhì)過氧化是脂類的氧化降解過程，其主要由活性氧類（ROS）引發(fā)。脂質(zhì)過氧化傳感器（Lipid Peroxidation Sensor）是通過一種 C11-BODIPY 581/591 試劑的氧化來檢測活細胞中的脂質(zhì)過氧化情況。 C11 BODIPY 581/591 本質(zhì)上是一種親脂熒光染料，具有良好的光穩(wěn)定性、低熒光偽影特質(zhì)，能積累在膜內(nèi)。 一旦染料的多不飽和丁間二烯基被氧化，熒光最大發(fā)射波長峰值從約 ～590 nm 偏移至約 ～510 nm，活細 胞的熒光從紅色變?yōu)榫G色，但仍維持親脂性，從而反映膜的脂質(zhì)過氧化水平。這種傳感器通常用于熒光顯 微鏡和流式細胞分析中，可視化監(jiān)測脂質(zhì) ROS 的生成和動態(tài)變化。

測定原理

LPO在酸性條件下加熱，產(chǎn)生小分子終產(chǎn)物 MDA，MDA與TBA，生成紅色產(chǎn)物，在 535nm有最大吸收峰。

使用方法

1. 流式細胞分析：

(1) 懸浮細胞：800 g 離心5 min 收集細胞沉淀；隨后PBS 洗滌細胞兩遍。

(2) 貼壁細胞：棄培養(yǎng)液，用常溫PBS 或培養(yǎng)液輕洗細胞2 次，隨后胰酶消化，800g 離心5 min 收集細胞沉淀，隨后PBS 洗滌細胞兩遍，每個樣本收集1~5 ×105 個細胞。【注】：操作過程中輕柔吹打細胞，消化時間不宜過長，劇烈吹打或胰酶消化過度會影響實驗結(jié)果。

(3) 脂質(zhì)過氧化傳感器用于脂質(zhì)過氧化檢測的推薦濃度為終濃度5μM；配制方法：用新鮮空白培養(yǎng)液配制終濃度為5μM 的脂質(zhì)過氧化傳感器染色液待用，DMSO 含量≤5‰?！咀ⅰ浚涸摬讲僮鹘ㄗh在消化細胞前準(zhǔn)備好，以免細胞消化后久置影響實驗結(jié)果。

(4) 將事先配置好的脂質(zhì)過氧化染色液加入收集的細胞沉淀中，推薦體積為500μL，隨后置于37℃孵箱，染色30min，期間5-10min 間隔輕彈細胞使其懸浮保證染色更充分。

(5) 染色結(jié)束后，800 g 離心5 min，棄上清，隨后用PBS 清洗細胞2 次，加入200μLPBS 重懸細胞用于流式分析。

2. 原位成像：

(1) 接種適當(dāng)密度的細胞于20mm 規(guī)格的蓋玻片上（也可用共聚焦小皿替代），給予實驗藥物處理適當(dāng)時

(1)間后，吸去培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細胞一遍；加入500 μL 配制好的脂質(zhì)過氧化染色液，于37℃染色30min；配制方法參考流式分析中的染色液配制。

(2) 棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌細胞兩遍后于熒光顯微鏡或激光共聚焦下進行成像檢測。細胞在染色后應(yīng)在1 h

(2)之內(nèi)完成檢測。

檢測條件

該分子探針在還原狀態(tài)下最佳激發(fā)波長為 581 nm, 發(fā)射為 591nm；被 Lipid ROS 氧化后最佳激發(fā)波長 為 500 nm，發(fā)射在 510nm。因此，在流式分析中檢測通道為 FL1-A；激光共聚焦檢測：氧化態(tài)激發(fā)波長可 選 488nm（FITC）通道；還原態(tài)激發(fā)波長可選 561 nm（TRITC）通道。

注意事項

1、臨用前注意試劑二是否溶解，如未溶解，可以 70℃-90℃加熱，并振蕩以促進溶解。

2、使用前小心離心數(shù)秒取用，需佩戴手套操作，注意避免與皮膚、眼睛和黏膜接觸。