Protein A瓊脂糖凝膠

Protein A瓊脂糖凝膠通常用于從血清、細胞培養上清或腹水中分離抗體，以及從細胞或組織提取物中分離抗原進(jìn)行免疫沉淀和免疫共沉淀。蛋白A瓊脂糖偶聯(lián)高質(zhì)量的重組蛋白A，它可以結合抗體的IgG結合域。重組蛋白A含有5個(gè)的Fc結合結構域，這些結構域可以與許多不同物種的抗體結合，包括小鼠、人、兔、豬、狗和貓。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個(gè)月。

技術(shù)參數

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

2.用PBS 洗細胞一次，即用 PBS 將細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

3.用預冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。每50mg 細胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時(shí)加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min（期間混勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實(shí)驗（或置于-80 ℃長(cháng)期保存）。

血清樣品

　一般建議建議用IP Lysis/Wash Buffer稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為50~150 µg/mL，置于冰上備用（或置于-20 ℃長(cháng)期保存）。

免疫復合物的制備

【注】：樣品所需的量和孵育時(shí)間均依賴(lài)于每個(gè)特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優(yōu)化才能得到最大產(chǎn)量。

　以下實(shí)驗方案針對2-10μg 親和純化的抗體，根據需要可以按比例放大。

1.在離心管中，將每個(gè)樣品的細胞裂解液與2-10μg 免疫沉淀抗體結合。每個(gè)免疫沉淀反應推薦的總蛋白量為500-1500μg。

2.用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至300-500μL。

3.在室溫下孵育1-2 h，或4 ℃過(guò)夜，以形成免疫復合物。

免疫沉淀

【注】：為保證微球均勻分布，使用前通過(guò)反復顛倒或輕微渦旋混勻瓶中微球。

1.將25µLProtein A瓊脂糖加入1.5 mL 離心管中。

2.向離心管中加入500 µL 預冷PBS，輕柔混勻。

3.然后4℃、 1000g離心5min,去除上清。

4.向離心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數次或輕微渦旋混勻1min。4℃、1000g離心5min,去除上清。

5.將抗原樣品/抗體混合物加入裝有Protein A瓊脂糖的離心管中，保持混勻室溫下孵育1-2 h，或4℃過(guò)夜。

6.4℃、1000g離心5min，除去未結合的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。4℃、1000g離心5min收集瓊脂糖，棄上清。再重復洗兩次。

8.向離心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于100℃水浴或者金屬浴中加熱10 min。離心后，保留含有目的抗原的上清。

注意事項

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會(huì )導致微球聚集而降低結合能力。

3.IP實(shí)驗中不同類(lèi)型的抗體與抗原結合的親和性是有區別的，抗體與抗原結合還會(huì )受到IP Lysis/Wash Buffer的影響，因此，如使用本實(shí)驗步驟不能獲得最佳的實(shí)驗結果，可自行優(yōu)化操作細節或者篩選及配制緩沖液進(jìn)行實(shí)驗，推薦使用李記生物的相關(guān)產(chǎn)品，參照相關(guān)產(chǎn)品推薦。

4.瓊脂糖使用前應充分振蕩均勻。瓊脂糖應保存在儲存溶液中，防止干燥。

附錄：蛋白A與不同種類(lèi)的Ig，s及其亞類(lèi)的結合強度

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